苯丙酮尿症(PKU)是一种先天性代谢病，其特征是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变，苯丙氨酸羟化酶活性的丧失导致血液苯丙氨酸浓度过高，这将对大脑造成不可逆转的损伤。未经治疗的PKU患儿通常伴随进行性智力障碍和其他严重症状，包括湿疹、皮疹、自闭症、癫痫发作和运动障碍等。随着患儿的成长，可以观察到发育迟缓、行为异常及精神症状等。血液中苯丙氨酸(Phe)浓度升高是导致患儿精神缺陷的根本原因； Guthrie引入了一种基于大规模筛查检测PKU的方法，称为Guthrie检测[1]。目前，世界上许多地区都采用Guthrie检测或其他生化方法(如荧光检测法或酶比色法)来进行新生儿血液中Phe浓度检测，用于PKU的诊断和鉴别诊断。这些方法具有操作简便、成本低廉的优势。但酶法的准确性、精密度、灵敏度较低，荧光法检测快速、微量，其灵敏度和精确度明显高于酶法，但检测单个样本时比较费时。

高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)是一种检测与代谢疾病相关的多种生物标志物的新方法。HPLC-MS/MS技术具有灵敏度高、特异性好、易自动化、耗时短、试剂费用低、可以获取更多的定性信息等优点,大大提高了定量分析的准确性,是临床及科研工作中测定氨基酸的一种有效方法。与目前应用较多的酶法、荧光法相比较，该方法最大优点在于能够在短时间内 (2 min) 对一个样品中的几十种物质进行定性和定量，达到“一种实验检测多种疾病”的目的。另外,由于HPLC-MS/MS技术是根据物质的分子量进行定性，根据离子强度进行定量 ,从而具有较高的灵敏度和特异度。

本研究通过HPLC-MS/MS技术检测血滤纸片中Phe和Tyr浓度及其比值，同时采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法作为对照，对内蒙古地区新生儿PKU进行筛查，为内蒙古地区PKU的诊断、治疗和预防提供一定的参考依据。

对象与方法

1.研究对象：2015年10月—2017年8月在内蒙古地区妇幼保健院分娩，并采集了血标本的新生儿12 910例为研究对象，其中12例因样本污染、2例因临床信息有误被排除，最终共有12 896例新生儿纳入本研究。

2.标本采集：在新生儿出生72 h内，收集足底外周血，在Whatman 903滤纸(Maidstone，UK)上点样，然后在室温下避光风干，并将滤纸干血片样本密封于真空塑料袋，保存于4℃冰箱。对于体重低于2 500克的新生儿，样品采集将推迟，直至体重达到2 500克后再采样。所有新生儿父母在收集样本前均已提交书面知情同意书。

3.检测流程：样本分别采用HPLC-MS/MS和TRFIA两种方法进行PKU筛查。将筛查结果为高风险的患儿召回进行二次复查，若结果依旧为高风险，则采用Sanger测序进一步对PKU相关基因PAH和PAH辅酶BH4的全部外显子区域及内含子/外显子交接区进行检测，若发现同源变体，则该患儿被确认为阳性病例。此外，还将检测高风险患儿父母的基因，以确定患儿的变异来源。

/MS检测：将直径为3.2 mm的干血斑置于 96孔过滤板中，每孔加入含有氨基酸和酰基肉碱同位素内标的100 μL抽提缓冲液 。在45 ℃下以750 rpm振荡密封孵育45分钟后，将75 μl提取物转移至API3200MD(Applied Biosytems，USA)用于进一步分析。在前体离子扫描模式下扫描内标酰基肉碱，在27 eV碰撞能量下质荷比(m/z)为85，并且在中性丢失谱扫描模式下用m/z 102(12eV)扫描氨基酸。利用软件NeoBase(Perkin Elmer)和GCMS Solution(Shimadzu)分析并予以整理分析。测试结果phe浓度>120 nmol/l(即2 mg/dl)，phe/tyr浓度比>1.5即为高风险。

5.TRFIA检测：使用新生儿苯丙氨酸试剂盒(PerkinElmer，Finland)分析新生儿的血液Phe浓度。在每个直径为3.2 mm的干血斑中打孔取样后，置于含15 μl提取缓冲液的96孔酶标板中。将板在室温下孵育60 min，加入40 μl超纯水并混合，之后将25 μl混合物转移至含有50 μl茚三酮的96孔滴定板中。在60 ℃温育60分钟，加入200 μl铜试剂，将平板在60℃下恒温90分钟，最后转移至Multilabel Counter(1420 VICTOR2D，PerkinElmer)进行Phe浓度测试。定量时，该批次包含1个空白品、6个标准品(0.4 mg/dl、1.6 mg/dl、2.8 mg/dl、5.2 mg/dl和15.0 mg/dl)和2个质量对照(1.3 mg/dl和5.2 mg / dl)。测试结果Phe浓度>2 mg/dl即为高风险。

6.Sanger测序：两种方法筛选出的高风险病例进行PAH及辅酶BH4的Sanger测序，结合血液Phe浓度最终确诊PKU病例。对PAH基因的13个外显子及其内含子交接区域的10 bp内含子进行PCR扩增并测序。

7.追踪回访：对于筛查结果为阳性，测序结果为阴性的患儿每月监测Phe浓度是否低于2 mg/dl，持续半年以上，并且每半年一次电话追踪回访，询问患儿生长发育、精神表现、皮肤毛发表现等是否正常，确保没有遗漏的阳性病例。

文章来源：《内蒙古中医药》 网址: http://www.nmgzyybjb.cn/qikandaodu/2020/0826/507.html